基因組信息在生命科學研究中具有重要價值。隨著價格的下降，基於三代長讀長的測序組裝越來越廣泛地應用於基因組學研究(Nat Methods 2022;Nat Rev Gene 2024)；其中，PacBio高保真（High-fidelity,HiFi）測序技術因其高精度的測序質量被認為是三代測序的金標準。然而，其標準建庫方法需要大量DNA輸入（>1 μg），限製了其在小型昆蟲或珍稀樣本中的應用(Proc Natl Acad Sci U S A 2021; Nucleic Acids Res 2020)。DNA擴增雖然可以降低樣本輸入量，但會引入擴增偏好和人工嵌合序列等錯誤，影響基因組的完整性及變異檢測的準確性。因此，低DNA用量、無擴增且操作簡單的PacBio建庫方法亟待開發。

2024年7月5日，必威精装版app西汉姆联 張勇研究組與中國農業科學院深圳農業基因組研究所阮玨研究組在Nature Communications雜誌上在線發表了題為“Low-input PacBio sequencing generates high-quality individual fly genomes and characterizes mutational processes”的論文。該研究開發了一種基於Tn5轉座酶的低DNA用量（100 ng）、無擴增、低成本的PacBio建庫技術LILAP。團隊利用該技術實現了兩個單隻雄性黑腹果蠅的全基因組測序和高質量組裝，同時獲得了內共生菌Wolbachia完整基因組，展示出LILAP的應用價值。基因組分析還發現了兩個突變特性：複雜轉座事件更傾向於發生在non-B DNA序列富集的區域；基因轉換（gene conversion）事件使轉座子同質化。

首先，LILAP利用Tn5轉座酶和發卡結構的PacBio測序接頭組成二聚體轉座複合物，一步實現DNA片段化和測序接頭連接（圖1）。所有流程在單個試管內進行，最大限度減少了建庫過程中的DNA損失，簡化了建庫流程。與PacBio公司的標準建庫和低DNA擴增建庫方法不同(Genes 2019;Genome Biol 2021)，LILAP無需特殊實驗儀器，所有試劑均可在第三方公司購買，建庫成本降至每個樣品10美元。同時，測序接頭內還可添加條形碼（barcode），用於多樣本混合建庫測序(Genome Biol 2010)。

研究人員進一步使用黑腹果蠅ISO1品係對該技術進行評估，結果顯示兩個單隻果蠅的讀段測序質量中位數達到36（即堿基錯誤率低於0.02%）。從頭組裝的基因組N50數值超過6 MB，質量分數(QV)超過60（即堿基錯誤率低於10^-6），保守單拷貝基因（BUSCO）組裝覆蓋度大於98%，遠超已發表工作中單隻果蠅基因組的質量。

此外，研究者從基因組組裝結果中檢測到337個新近產生的結構變異，其中9個複雜結構變異為轉座子插入引發序列重複或缺失。這些複雜事件涉及兩種轉座子：DNA轉座子hobo (EMBO J 1986)和LTR逆轉座子Jockey (Microbiol Spectr 2015)。研究還發現複雜結構變異插入位點附近富集non-B DNA序列(Trends Genet 2023)，並提出轉座插入後繼續發生雙鏈斷裂，隨後易於出錯的DNA修複過程發生。

類似於結構變異，三代長讀長測序也使成簇的串聯單核苷酸多態性（clustered SNP,cSNP）的檢測更為精準。兩個單隻果蠅總檢測到1756個SNP位點，54.9%彼此臨近，位於1000 bp窗口內。32.5%的cSNP由轉座子貢獻，在基因組內可找到供體，表明基因轉換貢獻了cSNP突變產生 (Nature 2023)。進一步的分析結果支持基因轉換可在DNA和RNA水平同時發生。

最後，研究人員在全基因組組裝結果中發現了內共生微生物Wolbachia pipientis完整基因組，該微生物廣泛分布於節肢動物中。研究團隊檢測了Wolbachia基因組內變異情況，發現了3個新突變，為後續研究共生菌和宿主的互作提供了新的線索。

綜上所述，LILAP作為一種三代低DNA輸入量的建庫方法，在不擴增的前提下將PacBio測序DNA投入量降低至100 ng，適應於解析小型生物及其內共生體基因組。未來，LILAP可應用於更多場景（圖2）： DNA用量受限的小型生物多樣性探究及較大物種的體細胞變異分析；果蠅個體水平的全基因組關聯分析（GWAS）；宿主-共生體的協同進化研究。

張勇研究組聚焦重複序列的突變機製、功能演化及轉化研究，在重複基因與轉座子兩方麵有較深的積累 (Cell 2024；Nature Ecology & Evolution 2022/2024;Nature Biotechnology 2023)。為精準解析重複序列，研究組近年來致力於測序技術的開發；LILAP與已發表的二、三代高精度測序技術綜述（Genomics,Proteomics & Bioinformatics 2024）為該方向的近期進展。LILAP研究的第一作者為中國科學院動物所博士後賈行星、副研究員譚生軍、博士生蔡英傲。通訊作者除張勇、阮玨外還包括賈行星與譚生軍。郭言言、沈潔宇、張雅瓊、馬慧靜、張青竹、陳金鋒、喬格俠等合作者在文章寫作、實驗和計算分析等方麵提供了大力支持。該研究得到了國家重點研發計劃(2019YFA0802600)，國家自然科學基金(32325014)和中國科學院基礎前沿科學研究計劃(ZDBS-LY-SM005)的支持。

論文鏈接： https://www.nature.com/articles/s41467-024-49992-6

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圖1. LILAP測序技術原理示意圖

圖2. LILAP的潛在應用場景。a) 多樣性基因組學及體細胞突變檢測。b) 果蠅個體水平的GWAS研究。c) 宿主-共生體解析。